03/10/11

Microbiologia - Exame laboratorial com material fresco

Coleta de material para exame microbiológico
1- Introdução
A coleta, a conservação e o transporte de material ou amostra clínica constituem a base do trabalho microbiológico, que culmina com a identificação do agente infeccioso e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. A padronização desses procedimentos reflete na melhor utilização dos recursos da microbiologia, com maior qualidade dos resultados e economia de recursos.
2- Princípios Gerais
2.1- Pedido de exame
O processo microbiológico é feito de etapas interpretativas. As decisões em cada uma das etapas podem interferir no resultado final, daí a necessidade de uma interação entre as equipe da assistência e do laboratório de microbiologia. A primeira comunicação é feita por meio do pedido de exame.

O pedido de exame microbiológico (formulário próprio) deve informar:
  1. Nome, data de nascimento e registro do paciente
  2. Clínica, enfermaria, setor
  3. Dados clínicos, hipótese diagnóstica e o uso de antimicrobianos
  4. Material (precisar o tipo e a técnica e/ou o local da coleta)
  5. Especificar os exames#: microscopia direta (a fresco, campo escuro), com coloração (Gram, pesquisa de BAAR), cultura e antibiograma para bactérias, cultura e pesquisas especiais (anaeróbio, fungo, micobactéria, vírus)
  6. Data da solicitação e assinatura e nome legível do requisitante (informar o telefone de contato facilita a comunicação do laboratório com a equipe de assistência)
  7. Data, horário da coleta e o nome do responsável pela coleta

As amostras devem ser rigorosamente identificadas com rótulo, contendo:
8.                   Nome, registro do paciente e material, especificando a topografia.
2.2- Coleta do Material
A coleta deve ser realizada, sempre que possível, antes do início ou da modificação da terapia antimicrobiana.
O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso investigado, devendo ser eleito o melhor sitio da lesão. Por exemplo: as crostas das feridas devem ser removidas, uma vez que a melhor amostra localiza-se abaixo dessa crosta.
A coleta deve ser feita dentro de técnica asséptica, utilizando recipientes de boca larga e materiais estéreis e evitando ou diminuindo ao máximo a contaminação com a microbiota não representativa do processo infeccioso.


Conforme as normas de biossegurança#, todo material será colhido, acondicionado, transportado, processado e descartado como potencialmente infectante, independentemente do diagnóstico do paciente. Para evitar a exposição de risco biológico, observar as rotinas de cada procedimento e usar os EPI (luvas, máscara, óculos de proteção, avental) indicados.    
2.3- Acondicionamento, conservação e transporte do material
Todo material deve ser enviado ao laboratório em recipiente apropriado para o tipo de exame e material (conforme indicado pelo Laboratório) e devidamente acondicionado para evitar extravasamento do material durante o transporte. Para maior segurança no transporte do material, os frascos com sangue ou qualquer material devem ser transportados dentro de recipientes resistentes à perfuração e com tampa. Evitar a contaminação da superfície externa do frasco de coleta (se acontecer, fazer a desinfecção da superfície, com três aplicações de álcool 70%). Não contaminar o pedido de exame.
         Após a coleta, o material deve ser transportado ao laboratório no menor tempo possível. Quanto mais cedo iniciar o processamento da amostra no Laboratório de Microbiologia, maior a chance de recuperar o agente infeccioso e de beneficiar o paciente. Observar o tempo máximo para recepção da amostra (Tabela 1).
O ato de recepção deve ser protocolado com registro do horário e conferência da adequação do pedido e do material, cabendo recusa conforme protocolo específico.

Tabela 1 Acondicionamento e tempo máximo para recepção da amostra
Amostra
Tempo
Acondicionamento
Respiratória (escarro, aspirado traqueal, LAB#, BEP#)
30 minutos
Frasco seco estéril
Hemocultura
30 minutos (não refrigerar)
Frascos com meio de cultura
Fezes
30 minutos
Frasco seco estéril
Fezes em meio de transporte
12 horas
Meio Cary Blair
Urina
30 minutos
Frasco seco estéril
Urina refrigerada (4°  C )
4 horas
Frasco seco estéril
Swab em meio de transporte
Conforme o meio e a especificação do laboratório
Meio Stuart, Amies
Swab sem meio de transporte
Imediatamente
Cateter vascular (segmento)
Imediatamente
Frasco seco estéril
Líquor
Imediatamente (não refrigerar)
Frasco seco estéril / Kit do LACEN
Líquido pleural e outros líquidos de cavidade estéril
Imediatamente (não refrigerar)
Frasco seco estéril ou frascos com meio de cultura
Fragmento de tecido, ósseo
Imediatamente
Frasco seco estéril

(Adaptado de Ministério da Saúde. ANVISA. Manual de Microbiologia Clínica Para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde. Brasília- 2004 (versão preliminar)
  • Meio de transporte serve para manter a viabilidade das bactérias, porém sem permitir a multiplicação. Exemplos de meios especiais: Stuart, Amies, Cary Blair.
  • Material colhido com swab deve ser processado imediatamente ou imerso em meio de transporte. O swab conservado em meio de transporte é mantido, geralmente, em temperatura ambiente até o momento do processamento. Não ultrapassar o tempo indicado pelo laboratório (em geral, 8 horas).  
  • Material em que há suspeita da presença de bactérias mais sensíveis às variações de temperatura ou de umidade como: Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae e Streptococcus pneumoniae devem ser colhidos em meio de transporte ou no próprio meio de cultura. Não refrigerar e enviar imediatamente ao Laboratório de Microbiologia.
  • Material naturalmente rico em flora microbiana (fezes e escarro) ou obtido de sítios de difícil descontaminação (urina, secreções de orofaringe, lesões superficiais) deve ser transportado com os cuidados necessários à manutenção da proporção da flora original. Se o material for mantido à temperatura ambiente por período superior a 30 minutos, pode ocorrer multiplicação bacteriana (microbiota endógena) e, conseqüentemente, prejudicar o isolamento do agente infeccioso.
  • C. Na impossibilidade deste procedimento, coletar o material em frasco esterilizado e conservá-lo à temperatura ambiente, até o momento do processamento.° a 37°Material clínico proveniente de sítios estéreis (sangue, líquor, líquido ascítico, sinovial, etc.) deve ser colhido e semeado diretamente em meios de cultura, transportado à temperatura ambiente ao laboratório e colocado em estufa entre 35
3- Rotinas de coleta de material específico

Para todas as rotinas, observar:
  • Explicar o procedimento ao paciente e posicioná-lo adequadamente.
  • Após anti-sepsia cutânea com álcool ou soluções alcoólicas de PVP-I ou clorexidina, sempre aguardar até completa secagem espontânea.
  • Verificar antecedente de alergia ao anti-séptico, especialmente ao iodo. Independente de história prévia de alergia, sempre remover o iodo no final do procedimento.

3.1- Hemocultura
Momento da coleta e número de amostras:
Coletar antes do início do tratamento com antimicrobiano ou, se já estiver em uso de antimicrobiano, imediatamente antes da próxima dose. Não deve ser solicitada “coleta em pico febril”. O número de amostras e o intervalo entre as amostras são relacionados ao diagnóstico e à condição clínica do paciente:

Em adulto, observar as seguintes recomendações:
- Sepse e infecções localizadas (meningite, osteomielite, artrite, pneumonia, pielonefrite): Duas ou três amostras com punções diferentes. Caso exista urgência quanto ao início do tratamento antimicrobiano, coletar as amostras ao mesmo tempo, em locais diferentes (Ex: braço esquerdo e braço direito).
- Sepse relacionada ao cateter vascular: Duas ou três amostras antes da retirada do cateter vascular. Enviar também a ponta do cateter para cultura.
 dia, com intervalo mínimo de 1 hora. Se negativas após 24 horas de cultivo, coletar mais três amostras.°- Endocardite subaguda: Três amostras colhidas com punções diferentes no 1
Volume de sangue:
Quanto maior o volume de sangue, por amostra, melhor é a recuperação do microrganismo; porém, é necessário observar a proporção indicada de sangue / meio de cultura e a idade do paciente.
Método automatizado:
Em adultos –10 ml (volumes menores de sangue podem ser utilizados, porém com diminuição na freqüência de recuperação do agente infeccioso).
Em crianças – 1 a 4 ml em frasco pediátrico
Em neonatos – 0,5 a 1 ml em frasco pediátrico
Técnica de coleta:
É necessário um rigor na execução da técnica, uma vez que há possibilidade de crescimento de contaminantes da pele.
  • Higienizar as mãos (higiene com água e sabão ou fricção com álcool)
  • Após a retirada do lacre, desinfetar a tampa do frasco de hemocultura com álcool 70%
  • Selecionar um local de punção venosa
  • Fazer anti-sepsia rigorosa da pele com álcool 70%, em movimentos circulares e de dentro para fora. Esta área não deverá mais ser tocada com os dedos
  • Aguardar secar naturalmente (1 a 2 minutos), não soprar, abanar ou enxugar
  • Calçar luvas de procedimento
  • Coletar assepticamente a quantidade de sangue recomendada
  • Inocular nos frascos contendo o meio de cultura (aeróbio ou anaeróbio) e agitar levemente (Não é necessário trocar a agulha após a punção desde que não ocorra contaminação da agulha)
  • Identificar cada frasco, anotando nome, registro e horário da coleta em campo próprio no rótulo (não usar fita adesiva e nem danificar o código de barras do frasco)
  • Enviar imediatamente o material ao laboratório (não colocar em geladeira)

Obs:
1) Não é recomendada a técnica de coleta a partir de cateteres vasculares, exceto para fins de comparação com sangue periférico (método quantitativo ou aferição de período de crescimento).
2) Punção arterial não traz benefícios quanto ao isolamento de microrganismo.
3.2- Secreção de ferida cutânea ou cirúrgica, abscesso ou fístula
Preferencialmente, coletar material após lavar a lesão com soro fisiológico e/ou desbridamento. A secreção pode ser coletada de duas maneiras:
- por aspiração da secreção ou da coleção não-drenada utilizando seringa e agulha estéreis# ou somente a seringa (o material deve ser encaminhado imediatamente ao laboratório).
- com swab (é a técnica menos recomendada), tendo o cuidado de imergi-lo no meio de transporte ou encaminhá-lo imediatamente ao laboratório.
O termo “secreção de ferida” não é apropriado para informar o tipo de material. Relatar no pedido o sítio anatômico e as informações adicionais (tipo de lesão, secreção superficial ou profunda, fístula, etc.).
Técnica de coleta de secreção com a seringa:
  • Realizar anti-sepsia do local (pele íntegra). Se lesão aberta, fazer limpeza com soro fisiológico, de acordo com a técnica do curativo.
  • Aspirar o material com seringa e agulha estéreis ou somente com a seringa
    • As coleções drenadas podem ser aspiradas diretamente na seringa tipo insulina ou por meio de um pequeno cateter
    • Quando não houver secreção suficiente, injetar pequena quantidade de soro fisiológico estéril e aspirar com a mesma seringa
  • O material deve ser transportado na própria seringa, com eliminação do ar e vedação (principalmente nos casos de cultura para anaeróbio) ou em frasco estéril.
  • Anotar o horário da coleta, identificar o material e encaminhar ao laboratório
Técnica de coleta com o swab:
  • Realizar a técnica do curativo, até a limpeza com soro fisiológico e secagem com gaze esterilizada
  • Com o swab, coletar amostra do local# onde houver maior suspeita de infecção, porém evitando áreas de tecido necrosado e pus que devem ser removidos
  • Inserir o swab no invólucro especial ou no meio de transporte
  • Concluir o curativo
  • Anotar o horário da coleta, identificar o material e encaminhar ao laboratório

3.3- Fragmento de tecido (pele, tecido subcutâneo)
No caso de ferida ou lesão cutânea, a cultura de pequeno fragmento de tecido (biópsia) fornece resultado mais representativo do processo infeccioso em relação ao swab.
Técnica de coleta de fragmento de lesão (ou tecido):
  • Realizar a técnica do curativo até a limpeza com soro fisiológico e secagem com gaze esterilizada
  • Com o bisturi, tesoura ou instrumento para “punch” (se necessário, fazer anestesia local) retirar pequeno fragmento de tecido do local onde houver maior suspeita de infecção (+ 4mm), porém evitando áreas de tecido necrosado e pus, os quais devem ser removidos.
  • Inserir o fragmento no frasco de boca larga estéril e seco (se for realizar estudo histopatológico, retirar outro fragmento e colocar em frasco com formol)
  • Concluir o curativo
  • Anotar o horário da coleta, identificar o material e encaminhar imediatamente ao laboratório
3.4- Urocultura
A urina na bexiga é estéril, porém, com exceção da coleta suprapúbica, todos os métodos propiciam a contaminação da urina com a microbiota uretral. A coleta de urina do jato médio é o método mais utilizado, por não ser invasivo e pela relativa confiabilidade, quando realizada dentro de técnica adequada. A presença de piúria e de bactérias ao exame microscópico da urina não-centrifugada corada pelo Gram devem ser correlacionados.
Técnica de coleta do jato médio:
A coleta de urina deve seguir técnica rigorosa, evitando ao máximo a contaminação da urina com a microbiota da genitália. O ideal é a coleta da primeira urina da manhã, se não for possível, coletar de 2 a 3 horas de retenção urinária.
  • Explicar o procedimento ao paciente, que deverá lavar a genitália com água e sabonete (Não usar anti-séptico, pois interfere com o crescimento bacteriano)
  • Na mulher, afastar os grandes lábios para melhor higiene do meato uretral Lavar a região genital de frente para trás e não usar duas vezes a mesma gaze.
  • No homem, expor a glande para melhor higiene
  • Enxaguar com bastante água ou com gaze umedecida para retirar o excesso de sabonete e enxugar com toalha limpa ou gaze.
  • Coletar a urina do jato médio, isto é, desprezando a primeira e a última porção de urina, diretamente em frasco estéril de boca larga:
    • No homem, expor bem a glande
    • Na mulher, manter os grandes lábios afastados (o procedimento deve ser supervisionado por enfermeira ou auxiliar treinada).
  • Anotar o horário e identificar o frasco
  •  C) até no máximo 4 horas, mantendo a refrigeração durante o transporte (manter a temperatura com gelo ao redor do vasilhame)°Transportar ao laboratório imediatamente, ou refrigerá-la (a 4

OBS: Nos casos de crianças pequenas ou de pacientes incontinentes, fazer higiene dos genitais e do períneo aguardar a micção espontânea ou no último caso usar o saco coletor estéril, refazendo os cuidados de higiene do períneo e a troca do saco coletor de 30 em 30 minutos. Na pediatria do HRT, a experiência da coleta de urina sem o uso do saco coletor é feita há alguns anos e mostrou-se exeqüível. A criança pequena é deixada livre, sem a fralda, e o acompanhante atento coleta a urina diretamente no vasilhame estéril assim que a criança inicia a micção.  
Técnica de coleta por meio do cateter vesical:
- Paciente sem sonda vesical
O próprio cateterismo para coleta de urina implica em risco de infecção, porém esta técnica pode ser utilizada quando não é possível obter urina espontânea ou a punção suprapúbica é contra-indicada.
Fazer o cateterismo vesical dentro da técnica asséptica
- Pacientes com sonda vesical (pacientes cateterizados em sistema de drenagem fechada)
Trocar o cateter dentro da técnica asséptica e coletar a urina diretamente da luz do novo cateter, utilizando um recipiente estéril.
Não havendo troca de cateter, após a desinfecção com álcool a 70% do local, coletar a urina (20 ml) diretamente do cateter, por meio da punção com seringa e agulha estéril na proximidade da junção do cateter com o tubo de drenagem.
Técnica de coleta por punção suprapúbica:
É uma técnica invasiva, a ser utilizada nos casos:
-Resultados repetidamente duvidosos de cultura de urina obtida por outras técnicas
-Recém-nascidos ou crianças pequenas
-Suspeita de infecção por anaeróbios
-Contra-indicação de cateterização

Fazer a anti-sepsia da pele e coletar por meio de seringa e agulha

Obs: Para a pesquisa de BAAR e cultura para micobactéria, recomenda-se: coletar a primeira urina da manhã em três dias consecutivos (três amostras). Solicitar sempre a cultura uma vez que a pesquisa de BAAR fornece, muitas vezes, resultados falso-negativos.
3.5- Ponta de Cateter Intravascular
A técnica de cultura semiquantitativa (método de Maki ou do rolamento) da ponta de cateter é a mais utilizada para determinar a relação entre colonização externa do cateter e sepse. Para pesquisa de colonização intraluminal, outras técnicas são necessárias.
Técnica de retirada do cateter:
Os mesmos cuidados de anti-sepsia utilizados na introdução do cateter devem ser adotados no momento da retirada do fragmento do cateter para cultura:
  • Fazer uma rigorosa anti-sepsia da pele ao redor do cateter
  • Remover o cateter utilizando uma pinça estéril, com cuidado para não tocar o cateter na pele
  • Assepticamente, com tesoura ou lâmina estéril, cortar cerca de 5 cm da extremidade distal do cateter
  • Colocar o pedaço do cateter num frasco estéril de boca larga e sem meio de cultura
  • Anotar o horário e identificar o frasco
  • Transportar ao laboratório imediatamente, evitando a excessiva secagem

OBS.: catéteres aceitáveis para cultura semiquantitativa: central, PVC, Hickman, Broviac, periférico, arterial, umbilical, alimentação parenteral e Swan-Ganz.
3.6- Líquidos orgânicos estéreis (Pleural, Ascítico, Sinovial, bile, etc.)
  • Fazer anti-sepsia rigorosa da pele
  • Realizar a aspiração do material com seringa e agulha estéril, dentro de técnica asséptica
  • Inocular o material em um frasco de hemocultura-adulto (coletar 10 ml, de preferência)
  • Na impossibilidade da semeadura direta do material em meio de cultura ou quando o objetivo é pesquisar fungo ou micobactéria, colocar o material em frasco estéril e adicionar heparina para evitar coagulação do líquido
  • Anotar o horário e identificar o frasco
Enviar ao laboratório imediatamente (conservar em temperatura ambiente)

3.7- Líquor
A punção lombar deve ser feita sob condições estritas de assepsia. Recomenda-se que o material seja colhido diretamente no meio de cultura, já que uma demora na semeadura implica em grande queda das taxas de isolamento de bactérias. Tanto Neisserias como Haemophilus não resistem às temperaturas baixas, daí porque o líquor para cultura não deve ficar em geladeira.
  • Fazer anti-sepsia rigorosa da pele
  • Utilizar o kit especial do LACEN (Antes de iniciar a punção, retirar o kit da geladeira para que no momento do uso o mesmo esteja à temperatura ambiente)
  • Realizar a punção lombar e coletar no tubo de ensaio (com o meio de cultura) 5 gotas de líquor, de preferência diretamente da agulha que se encontra introduzida no espaço subaracnóideo
  • Coletar líquor para os demais exames, utilizando os dois frascos contido no Kit
  • Anotar o horário e identificar o frasco
  • Enviar todo o material imediatamente ao laboratório de Emergência

Obs: Para pesquisa de BAAR ou Cryptococcus (coloração com tinta da China),  coletar pelo menos 3 ml de líquor.
3.8- Escarro
         A orientação para a coleta deste material deve ser clara, evitando ao máximo coletar saliva ou material de vias aéreas superiores, preferencialmente a coleta deve ser feita sob supervisão direta da equipe de assistência.
Coletar pela manhã com o paciente em jejum, após higiene oral (escovar os dentes sem o uso de pasta dental e fazer gargarejos)
O escarro deve ser coletado após tosse profunda e depositado diretamente em frasco esterilizado de boca larga com tampa rosqueada
Encaminhar ao laboratório por período não superior a 30 minutos

Obs: Nos casos de suspeita de infecção por micobactéria ou fungo, coletar pelo menos três amostras, em dias consecutivos (1 amostra diária). Nos casos de suspeita de pneumocistose ou quando a expectoração é escassa, esta pode ser induzida por meio de inalação.
3.9- Aspirado traqueal (ou secreção endotraqueal)
         O aspirado traqueal é realizado em paciente intubado ou traqueostomizado por meio de sonda de aspiração estéril. A cultura desse material, assim como a de escarro para o diagnóstico de pneumonia, é muito questionável quanto à sua utilidade. Ainda que também controverso, utiliza-se cultivo de aspirado traqueal com técnica quantitativa com o objetivo de melhorar a especificidade.
Técnica:
  • Seguir a técnica asséptica de aspiração
  • Ao retirar a sonda de aspiração, o material colhido deve ser colocado em frasco de boca larga estéril ou se escasso, cortar a extremidade distal da sonda (± 5 cm) com auxílio de material estéril (lâmina ou tesoura) e colocá-la em frasco seco e estéril.
  • Anotar o horário, identificar o frasco e enviar imediatamente ao laboratório.
3.10- Secreção de Orofaringe (swab)

O principal objetivo é a recuperação do Streptococcus pyogenes.
Técnica:
  • Orientar higiene oral não utilizando anti-séptico ou pasta dental
  • Explicar o procedimento ao paciente e orientá-lo a abrir bem a boca
  • Usar abaixador de língua e com swab estéril fazer esfregaços sobre as amígdalas e faringe posterior, evitando tocar na língua ou na mucosa oral
  • Coletar material nas áreas com hiperemia, adjacentes aos pontos de supuração ou remover o pus ou placas coletando o material na mucosa logo abaixo
  • Colher dois swabs e enviar imediatamente ao laboratório para evitar a excessiva secagem
3.11- Secreção de Ouvido

- secreção do conduto auditivo externo:
  • Retirar o excesso de secreção de drenagem espontânea com salina e gaze estéril
  • Introduzir o swab estéril no conduto auditivo externo

- secreção do ouvido médio com membrana timpânica rota ou íntegra, é necessário espéculo e coleta por meio de swab ou aspiração com seringa.
3.12- Swab nasal (narinas anteriores)
A pesquisa de MRSA# em narinas anteriores é feita em situações epidemiológicas especiais, conforme orientação do NCIH.
Técnica
  • Introduzir o swab esterilizado# cuidadosamente na porção ântero-superior de uma das narinas com movimento giratório delicado e deslizá-lo lateralmente pela asa nasal interna.
  • Repetir o procedimento na outra narina com o mesmo swab  
  • Inserir o swab no invólucro especial ou no meio de transporte
  • Anotar o horário da coleta e encaminhar o swab ao laboratório
3.13- Secreção Ocular
Coletar o material do saco conjuntival, evitando contato com a pálpebra ou os cílios.
Técnica:
  • Limpar a secreção purulenta superficial com gaze estéril
  • Afastar a pálpebra e coletar com o swab o material do saco conjuntival, evitando coletar a secreção acumulada nos cantos
  • Introduzir o swab em meio de transporte, se não for possível a semeadura imediata.
  • Anotar o horário e identificar o frasco
3.14- Fezes (e swab retal)
Devem ser coletadas no início ou fase aguda da doença, quando os patógenos estão usualmente presentes em maior número. Preferir as porções mucosas e sanguinolentas do material. Na pesquisa de enteropatôgenos (Salmonella, Shigella, E. coli enteropatogênica) entrar em contato prévio com o Laboratório de Microbiologia ou o LACEN para orientação quanto ao tipo de material a ser coletado e os cuidados de conservação e transporte.

Técnica swab retal:
  • Usar swab de algodão, certificando-se de que a ponta da haste que suporta o algodão está bem revestida
  • Umedecer o algodão em salina estéril (não usar gel lubrificante)
  • Inserir no esfíncter anal, fazendo movimentos rotatórios
  • Ao retirar, verificar se existe coloração fecal no algodão
  • Anotar o horário da coleta e encaminhar o swab ao laboratório imediatamente ou usar meio de transporte

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